Rekombinante Expression und proteinchemische Charakterisierung einer potentiellen viralen (Mimivirus Acanthamoeba polyphaga) Lipoxygenase

Tatjana Gehring

doi:10.58662/9783965430716

Zusammenfassung

Lipoxygenasen (LOXn)sind Lipid-peroxidierende Enzyme, die bisher in zwei (Bakterien, Eukaryonten) der drei Domänen des irdischen Lebens nachgewiesen wurden. Echte virale LOXn wurden in der Literatur bislang noch nicht beschrieben.Da Viren die am weitesten verbreitete biologische Erscheinungsform auf der Erde darstellen und da sie als Vektoren für den horizontalen Gentransfer bedeutsam sind, sollte in der vorliegenden Arbeit geklärt werden, ob und in welcher Häufigkeit LOX-ähnliche Sequenzen in Viren vorkommen und ob virale LOX-ähnliche Sequenzen für funktionelle LOX-Isoformen kodieren.

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Bibliographische Angaben

Auflage: 1/2019
Copyrightjahr: 2019
ISBN-Print: 978-3-96543-053-2
ISBN-Online: 978-3-96543-071-6
Verlag: Lehmanns Media, Berlin
Sprache: Deutsch
Seiten: 148
Produkttyp: Monographie

Inhaltsverzeichnis

KapitelSeiten

1. Vorwort Kein Zugriff
2. Inhaltsverzeichnis Kein Zugriff
3. Abbildungsverzeichnis Kein Zugriff
4. Tabellenverzeichnis Kein Zugriff
5. Zusammenfassung Kein Zugriff
6. Abstract Kein Zugriff
7. Abkürzungsverzeichnis Kein Zugriff
8. Buchstabencodes der proteinogenen Aminosäuren Kein Zugriff
1. 1. 1.1.1. Lipoxygenasereaktion Kein Zugriff
  2. 1. 1.1.2.1 Klassifizierungskonzepte für Lipoxygenasen (spezifitätsbasiertes Klassifizierungsschema, verwandtschaftsbasiertes Klassifizierungsschema) Kein Zugriff
    2. 1.1.2.2 Protein-chemische Eigenschaften von Lipoxygenasen Kein Zugriff
    3. 1.1.2.3 Enzymatische Eigenschaften von Lipoxygenasen Kein Zugriff
  3. 1. 1.1.3.1 Vorkommen von Lipoxygenasen in den drei Domänen des irdischen Lebens(Bakterien, Archaeen, Eukaryonten) Kein Zugriff
    2. 1.1.3.2 Biologische Rolle von Lipoxygenasen bei Säugetieren Kein Zugriff
2. 1. 1.2.1 Definition und Klassifizierung der Viren Kein Zugriff
  2. 1. 1.2.2.1 Viren als Triebkraft der Genomevolution lebender Systeme Kein Zugriff
    2. 1.2.2.2 Viren als Krankheitserreger für Pro- und Eukaryonten Kein Zugriff
  3. 1. 1.2.3.1 Klassifizierung der Megaviren und deren Aufbau Kein Zugriff
    2. 1.2.3.2 Mimiviren als Subfamilie der Megaviren (Vorkommen und Bedeutung) Kein Zugriff
3. 1.3 Lipoxygenasen bei Viren Kein Zugriff
4. 1.4 Fragestellung Kein Zugriff
1. 1. 2.1.1 Geräte und Hilfsmittel Kein Zugriff
  2. 2.1.2 Chemikalien Kein Zugriff
  3. 2.1.3 Nährmedien, Puffer und sonstige Lösungen Kein Zugriff
  4. 2.1.4 Proteine und Kits Kein Zugriff
  5. 2.1.5 Plasmide und Oligonukleotide Kein Zugriff
  6. 2.1.6 Nukleotid- und Proteinsequenzen Kein Zugriff
  7. 2.1.7 Bakterienstämme Kein Zugriff
  8. 2.1.8 Eukaryontische Zellstämme Kein Zugriff
2. 1. 2.2.1. Datenbankrecherchen Kein Zugriff
  2. 2.2.2. Klonierung der mutmaßlichen Mimivirus-LOX Kein Zugriff
  3. 2.2.3. Transformation von E. coli-Zellen mit dem rekombinanten Expressionsplasmid und Plasmidamplifizierung Kein Zugriff
  4. 2.2.4. Sequenzierung des Expressionsplasmids Kein Zugriff
  5. 2.2.5. Prokaryontische Expression der mutmaßlichen Mimivirus-LOX in E. coli Kein Zugriff
  6. 2.2.6. Eukaryontische Expression der mutmaßlichen Mimivirus-LOX in HEK293-Zellen Kein Zugriff
  7. 2.2.7. Quantifizierung von pro- und eukaryontischer Expression Kein Zugriff
  8. 1. 2.2.8.1 LOX-Aktivitätsassay unter normoxischen Bedingungen Kein Zugriff
    2. 2.2.8.2. LOX Aktivitätstmessungen unter hyperoxischen Bedingungen Kein Zugriff
    3. 2.2.8.3. HPLC-Analytik Kein Zugriff
  9. 1. 2.2.9.1. Affinitätschromatographie Kein Zugriff
    2. 2.2.9.2. Gelfiltration (Fast liquid Chromatographie, FPLC) Kein Zugriff
  10. 1. 2.2.10.1. Bestimmung des Eisengehaltes Kein Zugriff
    2. 2.2.10.2. Massenspektroskopie der tryptischen Spaltpeptide Kein Zugriff
  11. 2.2.11. Sequenzalignments Kein Zugriff
1. 1. 1. 3.1.1.1. Lipoxygenase-ähnliche Sequenzen (Verbalsuche) Kein Zugriff
    2. 3.1.1.2. Filterkriterien zur Reduktion falsch positiver Suchergebnisse (Molekulargewicht, Eisencluster) Kein Zugriff
    3. 3.1.1.3. Aminosäuresequenzalignments der potentiellen Mimivirus-LOX mit humanen ALOX-Isoformen Kein Zugriff
2. 1. 3.2.1. Synthese und Amplifizierung der Mimivirus-LOX-cDNA Kein Zugriff
  2. 3.2.2. Konstruktion, Klonierung und Analyse der rekombinanten prokaryontischenExpressionsplasmide Kein Zugriff
  3. 1. 3.2.3.1. Expression des rekombinanten Proteins mit Hilfe des pQE9-Vektors Kein Zugriff
    2. 3.2.3.2. Expression des rekombinanten Proteins mit Hilfe des pET28-Vektors Kein Zugriff
    3. 3.2.3.3. Protein-chemische Charakterisierung der gereinigten rekombinanten potentiellen Mimivirus-LOX Kein Zugriff
    4. 3.2.3.4. Enzymatische Charakterisierung des gereinigten rekombinanten Proteins(HPLC basierter Aktivitätsassay) Kein Zugriff
3. 1. 3.3.1. Konstruktion und Klonierung des eukaryontischen Expressionsplasmids Kein Zugriff
  2. 1. 3.3.2.1. Testung der Expression des rekombinanten Proteins durch Immunoblotting Kein Zugriff
    2. 3.3.2.2. Testung der rekombinanten Expression mittels Aktivitätsassay Kein Zugriff
4. 1. 3.4.1. Elektrophoretische Trennung der rekombinant exprimierten potentiellen Mimivirus-LOX vom ko-gereinigten bakteriellen Protein Kein Zugriff
1. 4.1. Vorkommen und biologische Rolle von Lipoxygenasen Kein Zugriff
2. 1. 4.2.1. LOX-ähnliche Sequenzen bei Viren Kein Zugriff
  2. 4.2.2. Humanpathogene Viren besitzen keine LOX Gene Kein Zugriff
3. 1. 4.3.1. Die in E. coli exprimierte potentielle Mimivirus-LOX bildet einen hochmolekularenKomplex mit einem unbekannten E. coli-Protein Kein Zugriff
  2. 4.3.2. Das bifunktionale Polymyxin Resistance Protein ArnA bildet mit der potentiellen Mimivirus-LOX einen nicht-kovalenten Komplex Kein Zugriff
  3. 4.3.3. Biologische Bedeutung des bifunktionale Polymyxin Resistance ProteinArnA Kein Zugriff
  4. 4.3.4. Die potentielle Mimivirus-LOX zeigt keine Fettsäureoxygenaseaktivität unternormoxischen Bedingungen Kein Zugriff
  5. 4.3.5. Die potentielle Mimivirus-LOX zeigt keine Fettsäureoxygenaseaktivität unter hyperoxischen Bedingungen Kein Zugriff
  6. 4.3.6. Die potentielle Mimivirus-LOX konnte in HEK-Zellen nicht exprimiert werden Kein Zugriff
4. 1. 4.4.1. Biologische Rolle des horizontalen Gentransfers Kein Zugriff
  2. 4.4.2. Mechanismen des horizontalen Gentransfers Kein Zugriff
  3. 4.4.3. Mögliche Verbreitung von LOX-Genen durch horizontalen Gentransfer Kein Zugriff
5. Ausblick Kein Zugriff Seiten 124 - 125
6. Literaturverzeichnis Kein Zugriff Seiten 126 - 146
Publikationen Kein Zugriff Seiten 147 - 147
Danksagung Kein Zugriff Seiten 148 - 148